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Jun 23, 2023

皮内送達されたmRNA

Ingegneria Biomedica della Natura

Nature Biomedical Engineering (2023)この記事を引用

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メトリクスの詳細

メッセンジャー RNA 治療法の成功は、遺伝物質の機能的タンパク質への安全、効果的かつ安定した翻訳を可能にする送達システムの利用可能性に大きく依存します。 今回我々は、ヒト皮膚線維芽細胞から細胞ナノポレーションによって生成された細胞外小胞（EV）と、細胞外マトリックスα1 I型コラーゲン（COL1A1）をコードするmRNAを内包する細胞外小胞（EV）が、コラーゲンタンパク質移植片の形成を誘導し、コラーゲンにおけるしわの形成を減少させることを示す。光老化した皮膚を持つマウスの枯渇した皮膚組織。 我々はまた、マイクロニードルアレイを介したmRNAをロードしたEVの皮内送達が、動物の真皮におけるコラーゲンのより均一な合成と置換を延長させることを示した。 EV ベースの COL1A1 mRNA の皮内送達は、光老化皮膚の治療に効果的なタンパク質補充療法となる可能性があります。

メッセンジャー RNA 修飾技術の最近の開発により、mRNA 送達の治療効率が向上し、タンパク質補充療法や重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2 (SARS-CoV-2) ウイルスに対するワクチン接種など、短期的な臨床応用の可能性が高まりました1。 2. しかし、mRNA は本質的に無能であり、潜在的な免疫原性があるため、mRNA を送達媒体内にカプセル化する必要があります。 現在の mRNA 送達様式は、カプセル化と輸送のための脂質ナノ粒子 (LNP) キャリアの使用に中心を置いています 3,4。 しかし、LNP には、細胞毒性、不十分な体内分布、標的特異性および免疫原性の欠如など、いくつかの大きな課題があります。 これらの問題は、循環半減期を改善し、非特異的クリアランスを減らすために、LNP の表面 PEG 化（PEG はポリ（エチレングリコール）の略）が必要なことが原因である可能性があります 5,6。 特に、人への LNP の投与は、アナフィラキシー、過敏症、自己免疫性の有害事象と関連しています 7,8。 したがって、これらの LNP 関連の課題の一部を克服できる mRNA キャリアの同定は、mRNA ベースの治療法のさらなる開発に役立つと考えられます。

エキソソームや微小胞を含む細胞外小胞（EV）は、人体内での生体分子や mRNA などの核酸の輸送に主要な役割を果たしています9、10、11。 その結果、近年、EV は、その固有の生体適合性、生理学的障壁を通過する能力、および低い免疫原性により、核酸ベースの治療薬の有望なキャリアとして浮上しています 12,13。 LNP とは異なり、エキソソームを含む EV は体の細胞によって内因的に産生され、炎症反応のレベルの低下を引き起こします。 さらに、大量のエクソソームを安価かつ簡単に生産する戦略も開発されています。 我々は以前、ソース細胞の表面に一時的なナノメートル細孔を作成して、分泌されたEVへの完全転写mRNAの大規模なロードを可能にする細胞ナノポレーション（CNP）法を報告しました。 ここでは、ヒトの加齢により損傷した皮膚の病態生理学的特徴をよく模倣した急性光老化のマウスモデルを使用することにより、光老化に対する抗老化治療として、皮膚のコラーゲンタンパク質の損失を代替するエキソソームベースのCOL1A1 mRNA療法の有用性を示します15。肌。 mRNA の送達と保持の効率を向上させるために、ヒアルロン酸 (HA) マイクロニードル (COL1A1-EV MN) パッチを介したコラーゲン mRNA の送達により、真皮内での mRNA のより効率的な分布が可能になり、耐久性のあるコラーゲンが得られることも示しました。 -タンパク質の移植と光老化した皮膚のしわの改善された治療。

コラーゲンの不可逆的な損失による真皮の萎縮は、皮膚の老化の特徴です16,17。 皮膚のコラーゲンタンパク質の損失を回復することを目的とした数多くの方法が、市販薬や医薬品によるアプローチ（抗酸化剤 18、19、20、レチノイド 21、ペプチド 22、23）から医療機器（つまり、レーザー治療 24 や合成皮膚充填剤 25、26）に至るまで多岐にわたります。 。 しかし、これらの既存の技術はどれも、長期にわたる内因性コラーゲンの置換を達成して、皮膚の強度、ハリ、弾力を長期にわたって維持することはできませんでした27、28、29。 コラーゲンタンパク質の合成を担う線維芽細胞を刺激することも、皮膚の老化を短期的に制御する効果的な方法となり得ます30。 しかし、線維芽細胞は老化するにつれて増殖しコラーゲンを合成する能力を徐々に失い、その結果、アンチエイジング治療のための長期的なコラーゲン補充方法が課題となっています31。 これらの限界を克服するために、我々は、EVを介したmRNA送達を介して、光老化コラーゲン枯渇モデルにおいてコラーゲンタンパク質を置き換えることを目的とした。 ヒトコラーゲン I アルファ I (COL1A1) mRNA をロードした EV を生成するために、ナノポア表面上に新生児ヒト皮膚線維芽細胞 (nHDF) の単層をプレーティングし、COL1A1-GFP プラスミドで細胞をナノトランスフェクトすることを含む CNP 技術を採用しました (図 1a および補足図 1a)14。 トランスフェクションの翌日に、EV を培地から単離しました。 CNP 処理細胞は、前述のキュベット型平行電極を使用して実行された標準バルク エレクトロポレーション (BEP) で処理された細胞 32 や、培養中の未処理の nHDF と比較して、細胞当たりの EV 数が 10 倍高いことが判明しました (図.1b)。 各方法で生成されたEVは、ナノ粒子追跡分析（NTA）によって測定された直径約150 nmでピークに達するサイズ分布と、動的光散乱（DLS）によるモードピークの強度の80％によって特徴付けられました（図1cおよび補足）図 1b、c) 多分散指数 (PDI) は 0.12 ～ 0.25 です。 ウエスタンブロット実験により、CNP治療群のエキソソーム（CD9、CD63、TSG101）および微小胞（ARF6）バイオマーカーの発現が未治療群よりも有意に高いことが示され、分泌EVの増加が確認されました（補足図1d）。 動態解析により、電圧最適化されたEV放出はCNP誘導後8時間でピークに達し、次の24時間にわたって継続的な分泌が記録されたことがさらに示されました（補足図1e、f）。 逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応（RT-qPCR）により、CNP分泌EVにはBEP分泌EVの200倍以上のCOL1A1 mRNAが含まれ、非トランスフェクト細胞から分泌されたEVの3,000倍のCOL1A1 mRNAが含まれることが示されました（図1d） ）。 ゲルアガロースのバイオアナライザー評価により、約4,000ヌクレオチドで転写されたCOL1A1 mRNAの全長が実証されました（図1e）。 CNP によって調製された EV は、前臨床投与のために 4 °C で保存した場合に構造安定性を示し、クライオ電子顕微鏡 (cryo-EM)、原子間力顕微鏡 (AFM)、および NTA で評価した場合、外観、膜、およびサイズの特性に変化はありませんでした (補足図) .2a–c)。 さらに、EV内にカプセル化されたCOL1A1 mRNAは室温と4℃の両方で安定であり、血清安定性も示し、それにより将来の臨床有用性の可能性を強調しました（補足図2d、e）。

a、標的核酸送達のためのCNP生成EVの概略図。 b、コントロールとしてのPBSバッファー中の未処理nHDF、PBSバッファーのみを使用したBEPまたはCNPによって24時間以内に生成された細胞あたりのEV数（各グループのn = 3; *P = 0.048 コントロール vs BEP; **P = 0.005 コントロール vs CNP ; ##P = 0.002 BEP 対 CNP)。 c、ナノ粒子追跡分析によるEVの特性評価。 d、COL1A1 mRNAのRT–qPCRにより、CNPによって生成されたEVには、24時間以内にBEPおよびコントロールグループによって生成されたEVよりもはるかに大量の転写されたmRNAが含まれていることが明らかになります（すべてのグループでn = 3; **P = 0.002コントロール対BEP; * **P < 0.001 コントロール vs CNP; ###P < 0.001 BEP vs CNP)。 e、COL1A1-GFPプラスミドを使用してCNPから生成した3.78×108個のEVから抽出した全RNAのゲル電気泳動を、対照としての合成in vitro転写COL1A1 mRNAと比較した。 f、0時間、24時間および48時間でのCOL1A1-EVの異なるタンパク質濃度での処理後のnHDFの増殖（すべてのグループでn = 4;24時間：#P = 0.0107、10μg ml-1 vs 0μg ml処理後の COL1A1-EV のタンパク質濃度の -1; ##P = 0.002、20 μg ml-1 vs 0 μg ml-1; ###P < 0.001、30 μg ml-1 vs 0 μg ml-1; 48 時間: *P = 0.045、COL1A1-EV 治療の 10 μg ml-1 対 0 μg ml-1; ***P < 0.001、20 μg ml-1 対 0 μg ml-1; ***P < 0.001 、30 μg ml-1 対 0 μg ml-1）。 すべてのデータは 3 つの独立した実験からのものであり、平均値 ± sem として表示されます。b と d の比較には両側スチューデント t 検定を使用しました。 fの比較には一元配置ANOVAを使用しました。 a の回路図は BioRender.com で作成されました。

in vitroでのCOL1A1 mRNA含有EV（COL1A1-EV）の治療可能性を評価するために、培養線維芽細胞をCOL1A1-EVで48時間処理しました（補足図3a）。 線維芽細胞の増殖は、COL1A1-EV治療により用量依存的に増加することが観察されました（図1f）。 治療後、免疫蛍光顕微鏡下で緑色蛍光タンパク質 (GFP) と COL1A1 の共局在の増加によって証明されるように、COL1A1-EV で処理した線維芽細胞では COL1A1 タンパク質発現の上昇が観察されました。 対照的に、COL1A1レベルは、未治療群ではGFPの共局在がなければ実質的に低かった（拡張データ図1a、b）。 レシピエント細胞へのmRNA送達の成功は、COL1A1-EVで処理した線維芽細胞において、それぞれ定量的PCRおよびウェスタンブロット分析によって測定されたコラーゲンmRNA発現およびコラーゲンタンパク質レベルの上昇によってさらに確認されました（拡張データ図1c、dおよび補足図3b）。 。 さらに、COL1タンパク質の前駆体であるプロコラーゲンIは、COL1A1-EV処理後に大幅に増加し、未処理の線維芽細胞と比較してEV処理した線維芽細胞によるCOL1タンパク質合成の改善を示しました（拡張データ図1e）。 EVの細胞取り込みの共焦点顕微鏡イメージングは​​、レシピエント細胞へのEVカーゴ送達がクラスリン媒介エンドサイトーシスによって媒介され（補足図3c、d）、リソソーム脱出が可能であることを示しました（補足図4）。 まとめると、これらの発見は、機能的なCOL1A1 mRNAがCNPによってEV内に安定してカプセル化され得ること、およびこのCOL1A1-EV送達システムがin vitroでCOL1A1タンパク質発現を有意に増加させることができることを実証する。

in vivo での EV 媒介 COL1A1 mRNA 送達とタンパク質形成の動態を理解するために、インスリン針注射器を介して 2.7 × 109 コピー数の COL1A1 mRNA COL1A1-EV をマウスの真皮に送達しました。 COL1A1 mRNA定量化のためのRNAscopeによる組織学的分析のために、次の14日間にわたってマウスを屠殺した。 COL1A1 mRNAは、分娩後12時間で局所皮膚組織で有意に上昇していることが判明し、注射後24時間および48時間で顕著な減少が観察され、96時間までにベースラインのCOL1A1 mRNAレベルに戻りました（図2a、b）。 COL1A1 mRNA のタンパク質への in vivo 翻訳を、外植組織の免疫蛍光顕微鏡検査によって 30 日間にわたって評価しました。 GFP + COL1A1 + 免疫染色された移植片は、注入後12時間という早さで観察され、分娩後4日目にピーク蛍光が見られました（図2c〜e）。 免疫蛍光顕微鏡で観察したところ、GFP+ COL1A1+ タンパク質移植片は、注射後 4 日目から 30 日目まで時間依存的に減少することが観察され、COL1A1-EV 由来タンパク質の大部分は 30 日目までにターンオーバーしました。 これらの所見は、用量が低いことが証明されています。 COL1A1-EV 送達により、レシピエント組織に COL1A1 タンパク質の 3 ～ 4 日間のピークが生じ、注射後 30 日までにベースライン レベルまで減少します。

a、COL1A1-EVおよび生理食塩水対照の皮内注射後のRNAscopeによるヒトCOL1A1 mRNAのin situハイブリダイゼーション。注射後12時間、24時間、48時間、96時間、7日、10日および14日に測定。 スケールバー、100 μm。 b、細胞あたりの茶色のドットの平均数によるRNAscope結果の定量化。 c、共局在するGFPとCOL1A1タンパク質（RFP）の可視化による、COL1A1-EV由来タンパク質の経時的な免疫蛍光。 スケールバー、100 μm。 d、COL1A1-GFPタンパク質発現の蛍光強度定量化。 e、GFP+細胞の定量により、COL1A1-EV由来タンパク質移植片が30日間にわたって時間依存的に減少することが確認される。 すべてのデータは 3 つの独立した実験からのものであり、平均値 ± 標準誤差として表示されます。

皮膚の光老化は、太陽光や紫外線照射による皮膚のコラーゲンと細胞外マトリックス（ECM）タンパク質の破壊を特徴とし、しわの形成を引き起こします33,34。 COL1A1 mRNA EV が in vivo で分解したコラーゲンタンパク質を置き換える能力を評価するために、無胸腺ヌードマウスを 8 週間にわたって UV (311 nm) 照射で処理し、コラーゲンに続発する真皮のしわを生じさせる、前述の光老化モデルを採用しました。枯渇35（補足図5a）。 マウス皮膚のコラーゲンおよびエラスチン線維の分解における8週間のUV照射コースの有効性は、組織学的および組織分析によって確認されました（補足図5b-g）。 次に、UV照射したマウスの真皮コラーゲンを置換するCOL1A1-EVの治療可能性を、以下のいずれかの5回の注射コースで動物を治療することによって評価しました。 (1) EVにカプセル化された2.7×109コピー数のCOL1A1 mRNA（COL1A1-EV） (2) 脂質ナノ粒子にカプセル化されたコピー数 2.7 × 109 の COL1A1 mRNA (COL1A1-LNP)、(3) CNP カーゴ負荷のないコントロール EV (アンロード EV)、(4) 0.05% レチノイン酸局所治療 (RA) または ( 5) 生理食塩水のコントロール。 しわの形成は、治療開始後 0、4、7、14、21、28 日目に追跡され、組織学および皮膚石膏レプリカ分析のために 28 日目にすべての動物が屠殺されました 36 (図 3a)。 治療期間中の真皮のしわの顕微鏡写真では、生理食塩水対照群と比較して、COL1A1-LNP、無負荷EV、およびレチノイン酸グループでは、28日目までのしわの数と面積がわずかに減少していることが実証されました（図3b）。 対照的に、COL1A1-EVで治療した光老化マウスは、治療開始後7日目からしわの数と面積の減少を示し、14日目以降は非照射の偽対照で観察されたものと同様のレベルまで大幅に減少しました（図3c、d） ）。 治療開始後 28 日目に採取した背側皮膚の皮膚石膏レプリカにより、生理食塩水対照、レチノイン酸、無負荷 EV 対照および COL1A1-LNP と比較して、光老化皮膚の治療における COL1A1-EV の有効性が確認されました（拡張データ図 2）。 注目すべきことに、COL1A1-LNPは、生理食塩水対照、レチノイン酸、および負荷のないEV対照と比較して、しわの数および面積の減少も示しましたが、この効果はCOL1A1-EVほど顕著ではありませんでした。 COL1A1-EVとCOL1A1-LNPで処理した皮膚も、それぞれカットメーターとインストロン伸び計で測定したように、より高い弾性と硬さを示しました（補足図6）。

a、COL1A1-EVの5回の低用量注射の概略図とタイムライン（用量あたり2.7×109コピー数のCOL1A1 mRNA）。 皮膚組織を28日目に採取した。 b、しわの形成は、COL1A1-EV、COL1A1-LNP、負荷のないEV、0.05％レチノイン酸（RA）または生理食塩水の初回送達後0、4、7、14、21および28日目に追跡されました（すべてのグループでn = 4） ）。 偽グループは、UV 照射にさらされていない雌のヌードマウスで構成されました。 スケールバー、5 mm。 c、カスタムソフトウェアで定量化された背部皮膚のしわの総数（すべてのグループでn = 4; ※※ P = 0.0016 COL1A1-EVs vs 7日目の生理食塩水; ***P < 0.001 COL1A1-EVs vs 14日目の生理食塩水、 21 および 28; **P = 0.0089 COL1A1-LNP 対 21 日目の生理食塩水; **P = 0.0097 COL1A1-LNP 対 28 日目の生理食塩水; #P = 0.461 無負荷 EV 対 21 日目の生理食塩水; ##P = 0.0034 無負荷28 日目の EV 対生理食塩水; †P = 0.0142 RA 対 21 日目の生理食塩水; ††P = 0.0069 RA 対 28 日目の生理食塩水)。 d、背側皮膚のしわ領域の定量化（すべてのグループでn = 4; ※※ P = 0.0063 COL1A1-EVs vs 7日目の生理食塩水; ***P < 0.001 COL1A1-EVs vs 14、21および28日目の生理食塩水; **P = 0.0082 COL1A1-LNP 対 21 日目の生理食塩水; ***P < 0.001 COL1A1-LNP 対 28 日目の生理食塩水; ††P = 0.0040 RA 対 28 日目の生理食塩水; ##P = 0.0018 のアンロード EV 対 生理食塩水28日目）。 すべてのデータは 3 つの独立した実験からのもので、平均値 ± 標準誤差として表示されます。c と d の比較には二元配置分散分析を使用しました。 a の回路図は BioRender.com で作成されました。

COL1A1-LNP および COL1A1-EV の免疫原性副作用を評価するために、動物のサブグループから治療した皮膚を切除し、注射の 24 時間後に炎症を分析しました。 COL1A1-LNPで処理した皮膚は、偽対照およびCOL1A1-EVで処理した皮膚と比較して、発赤と腫れを示しました（拡張データ図3a）。 組織のフローサイトメトリーおよび酵素結合免疫測定法（ELISA）により、COL1A1-LNP（拡張データ図3b、c）およびTNF-α、IL-1などの高レベルの炎症性サイトカインを受けた組織内の好中球が優勢な大量の白血球浸潤がさらに明らかになりました。 6、IL-1β および IFN-γ (拡張データ図 3d–f)。 比較すると、COL1A1-EV治療を受けた組織は強い炎症反応を示さなかった。 これらの発見は、LNP が EV よりも実質的に免疫原性が高いことを示唆しています。

28 日目の評価後、動物のサブセットをさらに 4 週間保持して、しわの減少期間をモニタリングしました。 真皮のしわは、早ければ 1 週間後、治療開始後 35 日目から再発することが見られ、56 日目までに真皮のしわは統計的に治療前のレベルと区別できなくなりました (拡張データ図 4)。

COL1A1-EV送達による真皮コラーゲン生着を評価するために、治療開始後28日目にすべての群から皮膚を切除し、免疫蛍光顕微鏡法およびマッソントリクローム染色によって評価した。 組織学的分析と蛍光強度の定量化により、COL1A1-EV治療後に他のグループと比較してCOL1A1タンパク質発現が有意に回復したことが明らかになりました（図4a、b）。 マッソントリクローム染色により、COL1A1-EVを与えられたマウスでは、生理食塩水対照、レチノイン酸、アンロードされたEVまたはCOL1A1-LNP（図4c、d）。

a、偽対照群、生理食塩水対照群、RA治療群、無負荷EV治療群、COL1A1-LNPおよびCOL1A1-EV治療群におけるGFPおよびCOL1A1(RFP)タンパク質の免疫蛍光染色。 COL1A1-EV処置マウスは、処置開始後28日目に真皮および皮下組織にGFP+ COL1A1タンパク質移植片を示した。 スケールバー、200 μm。 b、すべての治療グループのCOL1A1タンパク質（RFP）の蛍光強度（すべてのグループでn = 3; ※※※P < 0.001 COL1A1-EVs vs 生理食塩水; ***P < 0.001 COL1A1-LNPs vs 生理食塩水; #P = 0.0386無負荷の EV 対生理食塩水; †P = 0.0218 RA 対 生理食塩水; +P = 0.0255 COL1A1-EV 対 COL1A1-LNP)。 c、すべてのマウスグループの表皮、真皮および皮下組織の代表的なマッソントリクロームコラーゲン染色。 コラーゲンは青いです。 スケールバー、200 μm。 d、COL1A1-EV群におけるコラーゲン線維の増加を示す真皮厚の定量化（全群n = 3; ※※※P < 0.001 COL1A1-EV対生理食塩水; ***P < 0.001 COL1A1-LNP対生理食塩水; #P = 0.0437 負荷のない EV 対生理食塩水; †P = 0.0447 RA 対 生理食塩水; +++P < 0.001 COL1A1-EV 対 COL1A1-LNP)。 すべてのデータは 3 つの独立した実験からのものであり、平均値 ± 標準誤差として表示されます。b と d の比較には一元配置分散分析を使用しました。

COLA1-EV治療中止後1か月以内に光老化動物のしわがベースラインレベルに戻ることが判明したため、次にHAマイクロニードル製剤（COL1A1-EV MN）を設計することで、タンパク質置換の期間とコラーゲン生着の有効性を改善することを目指しました。 EVを介したmRNA組織送達を改善します。 カスタム マイクロニードル パッチは、COL1A1-EV を PBS に溶解した 15% HA 溶液と混合し、真空を 30 分間維持してポリジメチルシロキサン (PDMS) モールドの先端にキャストするマイクロモールディング法を使用して調製しました。その後、1 ml 15 wt% HA 溶液をマイクロモールドに入れ、固化させるために 4 °C に 4 時間移しました (図 5a)。 COL1A1-EV マイクロニードルパッチの各針は、根元の円直径が 400 μm、高さが 1,000 μm の円錐形に成形されています（図 5b）。 EVが負荷された10％、15％、または20％のHAを含むパッチの機械的強度は、引張試験機を使用して評価されました（補足図7a）。 15％COL1A1-EV MNの荷重破壊力は、皮膚貫通に必要な最小平均力（0.058 N）よりも高いことが確認されました37（補足図7b）。 ヘマトキシリンおよびエオシン (H&E) 染色により、マイクロニードルが角質層を通って真皮 (516 ± 76 μm) に浸透したことが確認されました 38 (図 5c)。 HA マイクロニードルにロードされた COL1A1-EV は、透過型電子顕微鏡 (TEM) と AFM によって評価されたように、安定した外観と膜の完全性、および安定した COL1A1 mRNA と粒子サイズ分布を有することがわかりました (補足図 7c–f)。 組織に送達するために、COL1A1-EV MN パッチをマウスの背側皮膚に押し込み、15 分後にマイクロニードルの基部を取り外しました (補足ビデオ 1)。 この期間中、マイクロニードルは完全に溶解し、投与部位に目に見える皮膚の炎症や跡は見られませんでした (図 5d および補足ビデオ 2)。 マイクロニードルを介して送達されたEVの組織分布とインスリン注射器によって送達されたEVの組織分布を比較するために、EVをDiI（1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3'-テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩; Beyotime、C1036）で標識しました39。そしてレシピエントマウスの背側皮膚の下に皮内投与し、その後免疫蛍光顕微鏡による組織学的評価を行った（図5eおよび補足図8a、b）。 組織分布分析により、注射針注射では真皮および皮下組織の特定の領域に凝集を伴う不均一なEVの送達が生じるが、マイクロニードルによって送達されたEVは真皮および皮下組織によりよく分散することが明らかになった（図5fおよび補足図8c、d）。 。 クライオEMによるEV膜の完全性の評価では、マイクロニードルパッチと注射針で送達されたEVではEV膜溶解が少ないことが示されました（18.1±3.0％COL1A1-EV MN対28.3±2.4％針注射、P = 0.022）（補足図） .8e、f)。 改善された組織分布とEV膜保護がEV生着の改善をもたらすかどうかを評価するために、次に、14日間にわたってマウスに皮内注射されたDiI標識EVの連続in vivo蛍光イメージングを採用しました。 蛍光イメージングにより、注射後の最初の 4 日間、シリンジ送達 EV とマイクロニードル送達 EV の間で同様の DiI EV シグナルが確認されました。 ただし、COL1A1-EV マイクロニードル群は、4 日目 (69.61 ± 6.4% COL1A1-EV MN 対 45.79 ± 2.5% 針注射、P < 0.001) および 7 日目 (35.78 ± 5.9% COL1A1-EV MN) で有意に高い蛍光シグナルを示しました。対 19.38 ± 3.8% 針注射、P < 0.001)、注射後 10 日目まで持続しました (30.22 ± 2.6% COL1A1-EV MN 対 6.68 ± 1.3% 針注射、P < 0.001) (図 5g、h)。 2 週間にわたる DiI プローブ蛍光の Ex vivo 臓器分布分析により、皮内注射を受けた動物とマイクロニードル送達を受けた動物の間で同様の組織分布とシグナル減衰が明らかになりました。これは、シグナル強度の減少が、示されているように DiI プローブの代謝によるものであることを示唆しています。他の同様の研究でも40、41（補足図9a、b）。 総合すると、これらの発見は、マイクロニードル パッチの使用により組織内での EV の長期保持が改善されることを示しています。

a、マイクロニードル製造の概略図。 b、マイクロニードルアレイの顕微鏡および走査型電子顕微鏡画像。 スケールバー、500 μm。 c、マウス皮膚の H&E 染色切片は、単一のマイクロニードルの貫通を示しています。 スケールバー、100 μm。 d、上：皮膚に押し込まれたHA EVマイクロニードル先端の時間経過。 マイクロニードルは適用後 15 分以内に溶解しました。 スケールバー、200 μm。 下: HA EV マイクロニードル治療後の皮膚の回復は最小限の刺激を示しています。 スケールバー、5 mm。 e、Dil標識EVの皮膚組織学では、注射針注射後の皮下組織に高濃度のEV（赤）が不均一に分布しているのに対し、マイクロニードル送達EVは組織内により均一に分布していることが示されています。 黄色の破線は、代表的な皮下毛球を囲み、真皮まで上向きに延びる毛包の代表的な棒状部分を境界付けます。 スケールバー、100 μm。 f、ImageJ ソフトウェアによって分析された代表的な EV 分布。 g、分娩後1、2、4、7、10および14日目にDil標識EVの皮内注射またはHAマイクロニードルパッチ送達で処理したヌードマウスのin vivo蛍光画像（すべてのグループについてn = 3）。 h、14日間の処理期間にわたる蛍光強度の定量化。 データは1日目の蛍光強度に正規化されています。すべてのデータは3つの独立した実験からのものであり、平均値±標準誤差として表されています***P < 0.001 COL1A1-EV MN送達グループ対針送達グループ。 hの比較には二元配置ANOVAを使用しました。 a の回路図は BioRender.com で作成されました。

次に、COL1A1-EVを送達するためのカスタムCOL1A1-EVマイクロニードルパッチの使用により、光老化マウスの皮膚における生体内タンパク質置換の改善がもたらされるかどうかをテストしました（補足図10）。 無胸腺マウスを再び 8 週間 UV 照射し、5 つの治​​療グループのうちの 1 つに割り当てました: (1) 生理食塩水コントロール、(2) 注射針によって送達された COL1A1 mRNA EV、(3) HA マイクロニードル コントロール、(4) 注射針によって送達された負荷のない EV HA マイクロニードル (アンロード EV マイクロニードル) および (5) HA マイクロニードルによって送達された COL1A1 mRNA ロード EV (COL1A1-EV MN)。 治療タイムラインの0日目に、すべてのマウスに22×109コピー数のCOL1A1 mRNA（または対照群の場合は同等のビヒクル量）を単回投与しました。 注射後、最長 3 か月間、すべてのマウスの背部の皮膚のしわを顕微鏡写真で観察しました (図 6a)。 治療前のベースラインに戻るまで最大 35 日間しわの形成を減少させた注射針注射と比較して、COL1A1-EV MN による COL1A1 mRNA の送達は、復帰までの最大 70 日間しわの面積と数を大幅に減少させることが判明しました。ベースラインレベルまで上昇しました（図6b、c）。 これらの所見をさらに確認するために、背中の皮膚と組織構造の皮膚レプリカ石膏評価のため、治療後 1 か月、2 か月、および 3 か月後に各グループのマウスのサブセットを屠殺しました（拡張データ図 5a-c）。 針注射とCOL1A1-EV MN治療の両方により、治療後最大1か月間、しわの長さと深さが減少しました（拡張データ図5d、e）。 しかし、COL1A1-EV MNで治療したマウスのみが、最大2ヶ月の時点まで、しわの長さと深さの顕著な長期にわたる減少を示しました。 コラーゲンの置換としわの治療が長期間維持できるかどうかをテストするために、追加の動物コホートを30日ごとに注射針とマイクロニードルによって送達されるCOL1A1-EVの連続治療に供しました。 注射針によって送達されたCOL1A1-EVとCOL1A1-EV MNは両方とも、動物が治療を受けている限り、しわの数と面積を減少させることが判明し、COL1A1-EV MN動物が最も改善を示しました（拡張データ図6）。

a、単回注射後の 4 つの治療グループの長期 (91 日) 観察: (1) 生理食塩水コントロール、(2) 28G 注射針によって送達された COL1A1-EV (22 × 109 コピー数 COL1A1 mRNA)、(3) HAマイクロニードルコントロール、(4) HA マイクロニードルによって送達されたアンロード EV (アンロード EV マイクロニードル)、および (5) COL1A1-EV MN (22 × 109 コピー数 COL1A1 mRNA)、(すべてのグループで n = 4)。 スケール バー、5 mm b、しわの総数の定量化 (すべてのグループで n = 4; *P = 0.014 COL1A1-EV MN 対 7 日目の生理食塩水; *P = 0.038 COL1A1-EV MN 対 14 日目の生理食塩水; * P = 0.012 COL1A1-EV MN 対 21 日目の生理食塩水; *P = 0.039 COL1A1-EV MN 対 28 日目の生理食塩水; *P = 0.031 COL1A1-EV MN 対 35 日目の生理食塩水; *P = 0.03 COL1A1-EV MN 対42 日目の生理食塩水; *P = 0.022 COL1A1-EV MN 対 49 日目の生理食塩水; *P = 0.031 COL1A1-EV MN 対 56 日目の生理食塩水; **P = 0.008 COL1A1-EV MN 対 63 日目の生理食塩水; #P = 0.030 7 日目の針注射 対 生理食塩水; #P = 0.041 14 日目の針注射 対 生理食塩水; †P = 0.047 HA マイクロニードル 対 14 日目の生理食塩水)。 c、背部皮膚のしわの総面積の定量化（すべてのグループでn = 4; * P = 0.016 COL1A1-EV MN vs 7日目の生理食塩水; * P = 0.038 COL1A1-EV MN vs 14日目の生理食塩水; * P = 0.042 COL1A1 -21 日目および 28 日目の EV MN 対生理食塩水; *P = 0.026 COL1A1-EV MN 対 42 日目の生理食塩水; *P = 0.048 COL1A1-EV MN 対 49 日目の生理食塩水; #P = 0.033 7 日目の針注射 vs 生理食塩水; #P = 0.031 14日目の針注射対生理食塩水; #P = 0.042 21日目の針注射対生理食塩水)。 すべてのデータは 3 つの独立した実験からのもので、平均値 ± 標準誤差として表示されます。b と c の比較には二元配置分散分析を使用しました。

治療後に採取した皮膚サンプルの組織学的分析により、分娩後1ヶ月の時点で、針注射群とCOL1A1-EVマイクロニードル群の両方で、マウスの真皮および皮下組織におけるGFP + COL1A1タンパク質の持続的な生着が確認されました（図7a）。 しかし、2ヶ月の時点までに、COL1A1-EVマイクロニードルコホートのマウスのみが、真皮および皮下組織におけるGFP+ COL1A1生着を示した(図7b)。 分娩後 3 か月の時点で、すべてのグループの皮膚サンプルは GFP コラーゲンの生着を示せませんでした (図 7c)。 COL1A1 + GFP免疫蛍光強度が定量化され、30〜60日目の効果的な治療と70〜90日目の治療前のベースラインへの戻りを実証したしわ顕微鏡所見を裏付けました（図7d）。 COL1A1 タンパク質の免疫組織化学的染色および皮膚組織のマッソントリクローム染色により、真皮内のコラーゲンの量が免疫蛍光顕微鏡所見と相関しており、すべてのコホートの中で COL1A1-EV MN グループが最も豊富なコラーゲン線維と最も高い真皮の厚さを有していることが確認されました (180.14 ± 21.46 μm COL1A1-EV MN 対 96.61 ± 14.00 μm 生理食塩水、1 か月後、P < 0.001; 154.88 ± 8.27 μm COL1A1-EV MN 対 2 か月後の 109.25 ± 10.86 μm 生理食塩水、P < 0.05) (図 7e、 f) 。 総合すると、これらの発見は、当社の COL1A1-EV MN システムを介した COL1A1 mRNA のカプセル化と送達により、光老化した皮膚におけるコラーゲンタンパク質の置換を、注射針送達期間の 2 倍以上延長できることを示しています。

a〜c GFPおよびCOL1A1（RFP）の免疫蛍光染色は、分娩後最大1か月（28日）、28G針注射およびCOL1A1-EV MNを介してCOL1A1-EVを投与されたマウスの皮膚にGFP陽性COL1A1タンパク質移植片があることを示しています。 2ヶ月(63日)の時点で、COL1A1-EV MNで処置したマウスのみが長期GFP陽性COL1A1生着を示した。 出産後 3 か月 (91 日) までに、どのマウスでも GFP 陽性コラーゲンタンパク質の証拠は検出されませんでした。 スケールバー、200 μm。 d、GFPとCOL1A1（RFP）の共局在蛍光シグナルの定量化は、COL1A1-EV MNを与えられたマウスと28G針注射によるCOL1A1-EVを与えられたマウスおよび対照群の皮膚における長期的なCOL1A1-EV由来コラーゲンの生着を示しています（すべてのグループについて n = 3; ***P < 0.001 COL1A1-EV MN 対 2 か月後の針注射）。 e、1か月（28日）、2か月（63日）、および3か月（91日）のCOL1A1タンパク質の免疫組織化学的染色およびマッソントリクローム染色。 スケールバー、200 μm。 f、マッソントリクローム染色による真皮厚さの定量化（すべてのグループでn = 3; **P = 0.0062 COL1A1-EV MN対1か月後の生理食塩水; *P = 0.034 COL1A1-EV MN対2か月後の生理食塩水）。 すべてのデータは 3 つの独立した実験からのものであり、平均値 ± 標準誤差として表示されます。d と f の比較には二元配置分散分析を使用しました。

細胞外小胞は、生体適合性、低い免疫原性、および健康なヒト細胞に由来する能力という固有の特性により、次世代の薬物送達システムとして浮上しています12。 それにもかかわらず、これまで核酸送達に焦点を当てた研究のほとんどは、マイクロRNAや低分子干渉RNA（siRNA）などの10〜20 ntの範囲の低分子をペイロードとしてカプセル化していましたが、mRNAなどのより大きな核酸はほとんど評価されていません。 EVへの積み込みの難しさ42。 ヒトの疾患を治療するための mRNA ベースの治療法の実用性が最近進歩したことに伴い、mRNA 送達システムとして EV を使用することへの関心が高まっています。 最近、我々は、核酸治療用に完全な内因性 mRNA を含む EV の大規模生産を可能にする mRNA ローディング技術を開発しました 14。 ここで我々は、mRNAを搭載したEVを真皮コラーゲン光枯渇モデルにおけるタンパク質補充療法に適用できることを示した17。 我々は、CNP が、挿入後ローディング法では達成できない、高コピー数の COL1A1 mRNA (約 4,000+ nt) を EV にロードできることを示しました 43,44。 in vivo の結果は、これらの COL1A1-EV が光老化後のマウス皮膚における COL1A1 タンパク質発現を回復できることを示しました。 また、in vivo で COL1A1 mRNA とタンパク質の存在を経時的に調べたところ、対応するタンパク質が分娩後 12 時間という早さで翻訳され、4 日目にピークを迎え、これが用量に応じて数週間持続することもわかりました。 いくつかの研究で、生体外でコラーゲン充填剤として COL1A1 タンパク質が生成されました。 ここで我々は、外因性 COL1A1 mRNA 送達と in vivo でのタンパク質発現の in vivo 動態を特徴付けました 45。

長期のタンパク質置換に私たちのアプローチを適応させるために、COL1A1-EVを送達するためのマイクロニードルアレイをさらに開発し、膜破裂を軽減しながら局所組織へのEVの均一な分布を可能にしました。 HA は細胞外マトリックスの重要な要素であり、皮膚組織およびさまざまな生体材料システムと優れた生体適合性を有することが確認されています 46,47。 EV を HA マイクロニードル生体材料に統合することにより、評価した皮膚標本における COL1A1 のタンパク質生着を 60 日以上延長することができました。 注目すべきことに、COL1A1 mRNAを負荷していないEVでも、しわの数がわずかに減少することができました。これは、特定の親細胞からの「空の」EVが内因性カーゴのおかげで潜在的な治療候補であることを発見した研究と一致しています（根底にある詳細なメカニズムは依然として不明です）このような現象についてはさらなる調査が必要です)36。

DNA ベースの遺伝子治療の発現が比較的長期間持続するのと比較して、mRNA 治療薬は遺伝子治療の進歩に役立ち、mRNA が核に浸透せずに細胞質に保持されるため有害事象のリスクを低下させる可能性があります 48,49。 したがって、mRNAベースの治療法は、従来の転写プロセスをバイパスできることや、（一部のアデノ随伴ウイルスベクターの使用とは対照的に）ゲノム組み込みのリスクがないなど、DNAベースやウイルスベースの遺伝子治療に比べて利点があります。これは伝統的にリスクが低いと考えられてきました50)。 しかし、mRNA治療薬の臨床応用はまだ限られています。 LNP を使用して開発された mRNA 製品の場合、LNP 表面の PEG 化成分の免疫原性および一部の担体製剤は、炎症および多数の安全性有害事象と関連付けられています 51,52。 実際、COL1A1-LNP と COL1A1-EV の in vivo 送達を比較したところ、COL1A1-LNP はコラーゲンタンパク質を生成し、真皮のしわを軽減することができましたが、局所組織に顕著な炎症性浸潤を引き起こしたのに対し、COL1A1-EV は炎症を引き起こしたことがわかりました。ない。 いくつかの最近の研究では、EV は低レベルの免疫原性を特徴とすることが示されており、いくつかの前臨床報告および臨床試験 (clinicaltrials.gov: NCT05191381、NCT05216562) では、さまざまな細胞型に由来する EV には免疫抑制効果があることが示唆されていますが、注意が必要です。これらの研究では、主に間葉系間質細胞と樹状細胞をドナー細胞タイプとして使用したことがわかっています 36,53,54。

COL1A1-EV MN の臨床応用における将来の課題には、mRNA が -80 °C 以下で保持されていない場合、急速に分解される可能性があるため、より高密度に保護された EV を備えたマイクロニードル形状の最適化や、最適化された保存条件が含まれます55。 理想的には、将来の EV システムは、すぐに使用できるアリコートとしてパッケージ化され、適切な温度で出荷されるため、臨床使用における COL1A1-EV MN システムの実用性が大幅に向上します。 また、表皮水疱症などの遺伝性孤児疾患に対する COL7 などのアイテムを含めて、システム内の治療用途を拡大することも目指します 56。 我々はマイクロニードルシステムを介してのみmRNAを送達しましたが、このシステムは、miRNAやsiRNAなどの他のタイプのEVカーゴや、ペプチドやタンパク質などの他の生物活性治療薬のパッケージングにも適しています57、58、59。 マイクロニードルベースのEV送達システムをヒトで試すには多くの課題を克服する必要があるが、EVはLNPやアデノ随伴ウイルス（AAV）と比較して生体適合性が改善されており、良性の副作用プロファイルがあるため、我々は彼らは、このシステムが人間のさまざまな病気や状態の治療のための普遍的な核酸キャリアを構成する可能性があると信じています。

nHDF (PCS-201-010) は ATCC から購入し、10% 熱不活化ウシ胎児血清 (FBS; 10099141C、Thermo Fisher) を含む DMEM 培地 (Thermo Fisher) 中で 37 °C、5% CO2 で平衡化した加湿条件で培養しました。 。

CNP の場合、前述のように、nHDF の単層を 1 cm × 1 cm 3D CNP 表面に播種し、一晩インキュベートしました。 GFP タグを含むヒト COL1A1 cDNA (NM_000088.3) プラスミドは、Sino Biological (HG11776-ACG) から購入しました。 ＰＢＳ緩衝液に予めロードされたプラスミドを、２５０Ｖｃｍ−１の電場強度、０．１秒間隔でパルス当たり１０ミリ秒の１０パルスを使用して、ナノチャネルを介して個々の細胞に注入した。 最適な条件を決定するために、さまざまなエレクトロポレーション条件をテストしました。 BEP (ジーンパルサー xcell、Bio-rad) は、電場強度 1,250 V cm-1、1 パルス 20 ms を使用して実行されました。 pCMV-COL1A1-GFPプラスミドを、トランスフェクションのためにPBS中で500ng ml-1の濃度で調製した。

細胞は血清を含むDMEM培地で培養されました。 血清を含む細胞培養液はCNPを行う際に除去した。 次いで、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＣＮＰ後、無血清細胞培地中で２４時間培養した。 EVは細胞培養上清から収集されました。 簡単に説明すると、細胞培養培地 (CCM) を 200 × g で 5 分間遠心分離して細胞と破片を除去し、その後、再度 2,000 × g で 30 分間遠心分離しました。 Amicon Ultra-4 遠心フィルターユニット (10 kDa、Millipore、801024) を使用して CCM を濃縮しました。 EV サンプルは、総エキソソーム単離試薬 (Invitrogen、4478360) を使用して精製されました。 EV の粒子サイズと数は、NanoSight NS300 (Malvern) を使用して測定されました。 RNA 収量とサイズ分布は、RNA 6000 Pico キット (Agilent Technologies) を備えた Agilent 2100 Bioanalyzer を使用して分析しました。

EV におけるヒト COL1A1 mRNA の発現は、メーカーの推奨プロトコルに従って RT-qPCR を使用して測定されました。 簡単に説明すると、RNA 精製ミニ キット (Norgen Biotek、55000) および DNA 除去キット (Norgen Biotek、25720) を使用して、精製された EV からの全 RNA を得ました。 SuperScript III First-Strand Synthesis システム (Invitrogen) を使用して、ランダム六量体をプライマーとして使用して、第 1 鎖相補 DNA を合成しました。 遺伝子の発現はTB Green Premix Ex Taq II（Takara、RR820）を用いて測定した。 使用したプライマー配列は以下の通りであった：COL1A1（ヒト）、順方向：5'-CCTGGAAAGAATGGAGATGA-3'、逆方向：5'-ACCATCCAAACCACTGAAAC-3'。 Gapdh (ヒト)、順方向: 5'-CAGCCTCAAGATCATCAGCA - 3'、逆方向: 5'-AGAGGCAGGGATGATGTTCT - 3' (補足表 1)。

ヌード雌マウス (10 ～ 12 週齢) をイソフルランで麻酔し、2.7 × 109 コピー数の CNP COL1A1 mRNA EV 50 μl を背部皮膚領域に注射しました。 皮膚注射後の所定の時点（１２、２４、４８、９６時間、７日、１０日、１４日）で、皮膚を切除し、固定のために４％ホルムアルデヒド中に置いた。 続いて、スライスをパラフィンに包埋し、さらに 4 μm のスライスに分割しました。 ヒト COL1A1 mRNA を検出するための RNAscope 自動 in situ ハイブリダイゼーション アッセイは、HybEZ II ハイブリダイゼーション システム (Advanced Cell Diagnostics (ACD)) を使用して実行され、すべての in situ ハイブリダイゼーション試薬は ACD 製品でした。 簡単に説明すると、Leica Epitope Retrieval Buffer 2 を使用してターゲットの回復を 95 °C で 15 分間実行し、続いて 42 °C で 15 分間プロテアーゼ処理を行いました。 プローブ (RNAscope Probe-Hs-COL1A1、401891、ACD) を 40 °C で 2 時間ハイブリダイゼーションし、続いて RNAscope 増幅を行い、染色の視覚化に RNAscope 2.5 HD Assay BROWN キットを使用しました。 RNAscope 2.5 LS プローブ-Rn-Ppib をネガティブコントロールとして使用しました。

組織切片を４％パラホルムアルデヒドで室温で２０分間固定し、ＰＢＳ（Ｖｅｔｅｃ）で各５分間３回洗浄した。 次に、組織を 0.2% Triton X-100 に 15 分間移し（透過処理）、続いて BSA で 40 分間ブロッキングし、一次抗体（ab34710 および ab6556、Abcam）を添加して 4 °C で一晩ブロッキングしました。 最後に、二次抗体 (ab6939 および ab6717、Abcam) を添加し、組織切片を室温に 60 分間置きました。 次いで、組織切片をＰＢＳで洗浄し、核染色のためにＤＡＰＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を添加し、その後、観察のためにマウントした。

組織切片を 4% パラホルムアルデヒドで 20 分間固定し、PBS (pH 7.4) で 5 分間ずつ 3 回洗浄した後、抗原回復溶液を含むエチレンジアミン四酢酸 (EDTA) (pH 9.0) 抗原回復溶液を含む回復ボックスに移して、抗原回復を行いました。電子レンジ。 続いて、切片を 3% 過酸化水素溶液中で室温、暗所で 25 分間インキュベートしました。 PBS で洗浄した後、組織を 3% BSA または 10% 正常ウサギ血清で均一に覆い、室温で 30 分間ブロックし、一次抗体 (ab34710 および ab6556、Abcam) を加え、4 °C で一晩インキュベートしました。 次に、一次抗体に対応する二次抗体 (HRP 標識) を加えて組織切片を覆い、室温で 50 分間インキュベートしました。 3,3'-ジアミノベンジジン (DAB) 発色のために、スライドを PBS (pH 7.4) に入れ、脱染シェーカーで各回 5 分間振盪しながら 3 回洗浄しました。 スライスを少し乾燥させた後、新たに調製したDAB発色現像液を円内に滴下した。 現像時間は顕微鏡下で制御した。 核の対比染色のために、ヘマトキシリン、ヘマトキシリン分化溶液、ヘマトキシリンブルーリターン溶液を順次添加した。 最後に、スライドガラスを無水エタノールとキシレンに入れて脱水し、密封しました。

動物実験は、深セン湾研究所の施設内動物管理使用委員会 (IACUC) (番号 D2021-107) またはパートナー研究所によって承認されました。 皮膚の光老化モデルを作成するために、メスのヌードマウス (10 ～ 12 週齢) の背部皮膚に、以下のように 8 週間隔日で UVB 照射を行いました。 マウスを 1.5% イソフルランで麻酔し、その後 UV 照射を行いました。マウスの背部皮膚の上30cmにUVランプ(Philips;発光スペクトル311nm)を置き、8週間隔日で照射した。 最小紅斑線量 (MED) として表される UV 照射強度は、最初の 2 週間は 1 MED (60 mJ cm-2) に設定され、3 週間目では 2 MED (120 mJ cm-2)、3 週目には 2 MED (120 mJ cm-2) に上昇しました。実験の 4 週間目は MED (180 mJ cm-2)、実験の 5 週間目から 8 週間目は 4 MED (240 mJ cm-2) でした。 照射された UVB の総量は約 80 MED でした。 光老化皮膚のシリンジベースの治療では、上記の 8 週間の照射期間の後、ヌード マウスを 6 つの治療グループのうちの 1 つに割り当てました (各 4 匹のマウス): (1) UVB 照射 + 生理食塩水、(2) UVB 照射 + 0.05% レチノイン酸、(3) UVB 照射 + 32G ハミルトン シリンジで送達されるアンロード nHDF-EV、(4) UVB 照射 + 2.7 × 109 コピー数 COL1A1 mRNA COL1A1-LNP、(5) UVB 照射 + 2.7 × 109 コピー数COL1A1 mRNA COL1A1- EVは32Gハミルトンシリンジで送達され、(6) UVB曝露なし(偽)。 皮膚の治療は 0、4、7、14、21 日目に行われました。分析のために背中の皮膚全体を 3 つの部分に分割しました。

SILFLO シリコーン レプリカとリング ロケーターは Clinical & Derm から購入しました。 マウスの背中（背側）皮膚のレプリカを治療期間の終了時に入手した。 レプリカは実体顕微鏡 (Olympus SZX7) によって分析され、対応する画像は ImageJ (NIH) によって分析されました。

マイクロニードルパッチの作製は、シリコンマイクロモールドを使用して行われ、各針キャビティは円形ベースの直径が400μm、高さが1,000μmでした。 これらの針キャビティは、先端から先端までの間隔が 700 μm の 10 × 10 アレイに配置されました。 マイクロニードルパッチの調製では、15 wt% HA 溶液 150 μl を 50 μl EV と混合し、真空下で 30 分間保持し、針腔内に堆積するまで 4 °C に移しました。 最後に、１５重量％のＨＡ溶液１ｍｌをマイクロモールド上に装填し、マイクロモールドを、固化のための蒸発プロセスを促進するために付属のファンを備えた乾燥チェスト内に置いた。 固化後、さらなる使用のためにマイクロニードルパッチをシリコーン型から取り外した。 カスタマイズされたマイクロニードル パッチを介した COL1A1-EV 送達を評価するために、ヌード マウスを上記のように 8 週間照射し、5 つの治​​療グループのうちの 1 つに割り当てました (各 4 匹のマウス): (1) UVB 照射 + 生理食塩水、(2) UVB 照射 + 28G ハミルトンシリンジによって送達される 22 × 109 コピー数の COL1A1 mRNA COL1A1-EV、(3) UVB 照射 + HA マイクロニードル パッチ、(4) UVB 照射 + マイクロニードル (アンロード EV マイクロニードル) および (5) UVB を介して送達される 1010 個のアンロード nHDF-EV放射線照射 + 22 × 109 コピー数の COL1A1 mRNA COL1A1- EV と混合した 15% HA マイクロニードル。

マイクロニードル処置マウスを、1、2、4、7、10、および 14 日目に in vivo イメージング システム (IVIS Spectrum、Perkin Elmer) でイメージングしました。パラメーターは次のように設定されました: 露光時間 15 秒、励起 570 nm、発光指定された蛍光イメージング時間で 680 nm、2F/絞り、視野 13.6 cm。 RFP 蛍光強度の定量分析は、対象領域内の平均放射効率 (光子 s-1 cm-2 sr-1 μW-1) を測定することによって実行されました。 データは1日目の蛍光強度に対して正規化しました。

定量的データは平均±標準誤差として表されます。この研究ではデータは除外されませんでした。 2 つのグループ間の統計的差異を分析するために、両側スチューデント t 検定を比較に使用しました。 2 つ以上のグループについては、Tukey の多重比較検定による一元配置分散分析 (ANOVA) を使用して統計的差異を分析しました。 グループ内のデータポイント間の統計的差異を分析するために、二元配置 ANOVA が選択されました。 P < 0.05 は統計的に有意であるとみなされました。 データ分析にはGraphPad Prism 8.3を使用しました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究の結果を裏付ける主なデータは、論文とその補足情報で入手できます。 図のソース データは、figshare (https://figshare.com/articles/dataset/SD_FIGS_xlsx/21514641) から入手できます。 研究中に生成された生のデータセットと分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて対応する著者から研究目的で利用できます。

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編集協力をしていただいた MD アンダーソンがんセンター放射線腫瘍科の C. Wogan に感謝します。

Yi You、Yu Tian、Zhaogang Yang の著者も同様に貢献しました。

北京大学深セン大学院、深セン、中国

イー・ユー、ユー・ティアン、ユーハオ・トン、アンドリアン・ポピー・エスタニア、ジャンホン・カオ、ウェイ・シャン・スー、ユートン・リウ、アンドリュー・S・リー

がん研究所、深セン湾研究所、深セン、中国

イー・ユー、ユー・ティアン、ユーハオ・トン、アンドリアン・ポピー・エスタニア、ジャンホン・カオ、ウェイ・シャン・スー、ユートン・リウ、アンドリュー・S・リー

テキサス大学 MD アンダーソンがんセンター放射線腫瘍科、米国テキサス州ヒューストン

Zhaogang Yang、Benjamin R. Schrank、JongHoon Ha、Shiyan Dong、Xuefeng Li、Yifan Wang、Wen Jiang

中国長春、吉林大学生命科学部

Zhaogang Yang、Ziwei Li、Yarong Zhao、Huan Zhang、Lesheng Teng

Spot Biosystems Ltd.、米国カリフォルニア州パロアルト

ジュンフェン・シー、クァン・ジュ・クァク、リー・ジェームス・リー

オハイオ州立大学、化学・生体分子工学部、米国オハイオ州コロンバス

チャン・チーリン

テキサス大学MDアンダーソンがんセンター脳神経外科、米国テキサス州ヒューストン

クリスティン・ハントゥーン、デヨン・リー、トーマス・D・ギャラップ、ベティ・YS・キム

広州医科大学第六付属病院、清遠人民病院。 中国・広州、広州医科大学基礎医科学部中仏ホフマン研究所呼吸器疾患国家重点研究所

李雪峰

中国医科学アカデミー深圳不維病院、深セン心血管疾患重点研究所、国家心血管疾患重点研究所および北京連合医科大学、深セン、中国

ウェンジン・ルー & フェン・ラン

北京心血管精密医療研究所、心血管疾患研究のための生体医工学重点研究所、教育省リモデリング関連心血管疾患重点研究所、首都医科大学北京安貞病院、中国北京

ルー・ウェンジン

米国テネシー州ナッシュビル、ヴァンダービルト大学医療センター皮膚科

エマン・バーラニ

テキサス大学 MD アンダーソンがんセンター、脳腫瘍センター、米国ヒューストン

クリスティン・ハントゥーン、デヨン・リー、トーマス・D・ギャラップ、ベティ・YS・キム

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ASLとFLがこの作品を考案した。 ASL、WJ、FL、ZY、BYSK が調査を監督しました。 ASL、JS、LJL、KJK がテクノロジーを開発しました。 ASL、YY、YT、FL、WJ、ZY、LT、BYSK が実験を設計しました。 ASL、LJL、ZY、YT、YY、WJ、FL、BYSK、KJK、JS、BS、KH、DL、TG、LT、W.-JL、EB は知的インプットを提供しました。 ASL、LJL、ZY、WJ、JS、SD、EB、BYSK が、すべての著者からの意見をもとに原稿を執筆しました。 YY、YT、JS、KJK、YT、APE、JC、C.-LC、W.-HHYL、ZL、YZ、HZ、XL、YW、JH が実験を実施しました。 YY、YT、ZY、APEは図とビデオを用意しました。

Feng Lan、Betty YS Kim、または Andrew S. Lee への通信。

ASL と LJL は、Spot Biosystems, Ltd. のコンサルタントおよび株主です。JS と KJK は、Spot Biosystems, Ltd. の従業員です。

Nature Biomedical Engineering は、この研究の査読に貢献してくれた Sun Hwa Kim、Chuanbin Wu、およびその他の匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

a、COL1A1-GFP EVで処理した血清欠乏nHDFの蛍光画像、および48時間後に送達されたCOL1A1-GFP mRNAから翻訳されたタンパク質。 スケールバー、100 μm。 b、COL1A1-EVで48時間処理した細胞の蛍光強度（全群n = 3、*** P < 0.001対照対COL1A1-EV）。 c、RT-qPCRは、48時間以内のEVからのCOL1A1 mRNAのin vitro送達後のより高いコラーゲンmRNA転写レベルを示します（すべてのグループでn = 3、*** P < 0.001対照対COL1A1-EV）。 d、ウェスタンブロットは、処理した線維芽細胞でCOL1A1タンパク質の上昇を示します（すべてのグループでn = 3、** P = 0.001対照対COL1A1-EV）。e、プロコラーゲンIは上清から収集され、ELISAによって検出されました（すべてのグループでn = 3）グループ、***P < 0.001 対照 vs COL1A1-EV) 48 時間。 すべてのデータは 3 つの独立した実験からのものであり、平均値 ± SEM として表示されます。 (b – e) の比較には、両側スチューデント t 検定が使用されました。

a、背側皮膚と皮膚レプリカの顕微鏡観察。 スケールバー、5 mm。 b、皮膚レプリカの平均しわの深さ（すべてのグループでn = 4、※※※P < 0.001 COL1A1-EVs vs 生理食塩水; **P = 0.0025 COL1A1-LNPs vs 生理食塩水; +++P < 0.001 COL1A1-EVs vs COL1A1 -LNP)。 c、皮膚レプリカで分析された平均しわの長さ（すべてのグループでn = 4、#P = 0.0203の無負荷EV対生理食塩水; *P = 0.0405 COL1A1-LNP対生理食塩水; ※※※P < 0.001 COL1A1-EVs対生理食塩水; ++ P = 0.0015 COL1A1-EV 対 COL1A1-LNP）。すべてのデータは 3 つの独立した実験からのものであり、平均値 ± SEM として表示されます。 (b、c) の比較には一元配置分散分析 (ANOVA) を使用しました。 NS、重要ではありません。

a、COL1A1-EVおよびCOL1A1-LNPに22E9コピー数のCOL1A1 mRNAを単回投与したマウスの皮膚サンプルを24時間後に採取した。 マウスの皮膚サンプルをフローサイトメトリーで分析し、b、白血球細胞の割合、c、好中球の割合を分析しました（すべてのグループで n = 3、**P = 0.0034 COL1A1-LNP 対 %CD45 + 細胞の偽、***P） CD45 + 細胞中の好中球の割合については、COL1A1-LNP 対シャムの < 0.001; NS、有意ではありません)。 d、IFN-γ、IL-1β、IL-6、およびTNF-αのELISAによるタンパク質定量は、COL1A1-EVと比較してCOL1A1-LNPグループで炎症性サイトカインの上昇を示しています（全グループでn = 3、**P） = 0.0074 COL1A1-LNP 対 IFN-γ の偽; #P = 0.0333 COL1A1-EV 対 偽、および ***P < 0.001 COL1A1-LNP 対 IL-1β の偽; ***P < 0.001 COL1A1-LNP 対 偽IL-6; *P = 0.0146 COL1A1-LNP 対 TNF-α の偽; NS、有意ではない)。 e、COL1A1-EVおよびCOL1A1-LNPを注射した後のTNF-αおよび(f)IL-6の代表的な免疫染色​​画像。 スケールバー、100 μm。 すべてのデータは 3 つの独立した実験からのものであり、平均値 ± SEM として表示されます。 (b〜d)の比較には一元配置分散分析が使用されました。

a、しわは、示された治療（COL1A1-EV（コピー数2.7E9 COL1A1 mRNA）の低用量注射5回）後0、4、7、14、21、28、35、42、49、および56日目に追跡されました。 、COL1A1-LNP (2.7E9 コピー数 COL1A1 mRNA)、アンロードされた EV、0.05% レチノイン酸 [RA]、生理食塩水)。 n = 4、スケールバー、5 mm。 UV に曝露されなかったメスのヌードマウスを偽グループとして構成しました。 b、経時的なマウスの背部皮膚のしわの数。 (すべてのグループについて n = 4; 7 日目で **P = 0.008 COL1A1-EV 対生理食塩水; **P = 0.004 COL1A1-EV 対 21 日目で生理食塩水、**P = 0.001 COL1A1-EV 対 35 日目で生理食塩水; ***P < 0.001 14、28、42、および 49 日目の COL1A1-EV 対生理食塩水; †P = 0.025 RA 対 21 日目の生理食塩水; ††P = 0.007 RA 対 28 日目の生理食塩水; ##P = 0.0071 14日目の無負荷EV対生理食塩水; ##P = 0.004 21日目の無負荷EV対生理食塩水; ##P = 0.002 28日目の無負荷EV対生理食塩水; #P = 0.015 35日目の無負荷EV対生理食塩水; ※※P = 14 日目で 0.0053 COL1A1-LNP 対生理食塩水; ※※ P = 21 日目で 0.0041 COL1A1-LNP 対 生理食塩水; ※28 日目で P = 0.017 COL1A1-LNP 対 生理食塩水; ※35 日目で P = 0.022 COL1A1-LNP 対 生理食塩水) 。 c、総しわ面積（すべてのグループでn = 4、*P = 0.012 COL1A1-EVs vs 7日目の生理食塩水; ***P < 0.001 COL1A1-EVs vs 14、21、28および35日目の生理食塩水; *P = 42日目で0.015 COL1A1-EV 対 生理食塩水; ††P = 14日目で0.008 RA 対 生理食塩水; ††P = 21日目および35日目で0.007 RA 対 生理食塩水; ††P = 28日目で0.005 RA 対 生理食塩水; #P = 0.012 無負荷 EV 対 14 日目の生理食塩水; #P = 0.035 無負荷 EV 対 21 日目の生理食塩水; ##P = 0.002 無負荷 EV 対 28 日目の生理食塩水; ※P = 0.062 COL1A1-LNP 対 14 日目の生理食塩水; ※P = 0.039 COL1A1-LNP 対 21 日目の生理食塩水; ※※ P = 0.0027 COL1A1-LNP 対 28 日目の生理食塩水; ※※ P = 0.046 COL1A1-LNP 対 35 日目の生理食塩水)。 すべてのデータは 3 つの独立した実験からのものであり、平均値 ± SEM として表示されます。 (b、c) の比較には二元配置 ANOVA を使用しました。

a〜c、治療後1か月、2か月、および3か月後の背部皮膚と皮膚レプリカの顕微鏡観察。 スケールバー、5 mm。 d、e 平均しわの長さの定量化（すべてのグループでn = 4、***P < 0.001 COL1A1-EV MN vs 1か月および2か月の生理食塩水; ###P < 0.001 針注射 vs 1か月の生理食塩水; † †P = 0.031 HA MN 対 1 か月後の生理食塩水;※※ P = 0.029 1 か月後の無負荷 EV MN 対 生理食塩水) および平均しわの深さ (すべてのグループで n = 4、***P < 0.001 COL1A1-EV MN 対 生理食塩水) 1 か月後; **P = 0.001 COL1A1-EV MN 対 2 か月後の生理食塩水; 1 か月後の針注射対生理食塩水は有意ではなかった; HA MN 対 1 か月後の生理食塩水は有意ではなかった) 皮膚レプリカから。 すべてのデータは 3 つの独立した実験からのものであり、平均値 ± SEM として表示されます。 (d、e) の比較には二元配置 ANOVA を使用しました。

a、8週間のUV照射光老化後、30日ごとに1)生理食塩水、2)COL1A1-EV、および3)COL1A1-EV MNで0、4、7、14、21、28日目に処置したマウスのしわを追跡した。 、49、70、および91 (COL1A1-EV、COL1A1-EV MN、生理食塩水)。 n = 4、スケールバー、5 mm。 b、総しわ数（全グループの n = 4; *P = 0.019 COL1A1-EV MN 対 4 日目の生理食塩水; #P = 0.034 COL1A1-EV 対 生理食塩水、*P = 0.031 COL1A1-EV MN 対 7 日目の生理食塩水; #P = 0.030 COL1A1-EV 対 生理食塩水、**P = 0.008 COL1A1-EV MN 対 14 日目の生理食塩水; **P = 0.008 COL1A1-EV MN 対 21 日目の生理食塩水; *P = 0.025 COL1A1-EV MN 対28 日目の生理食塩水; **P = 0.006 COL1A1-EV MN 対 35 日目の生理食塩水; #P = 0.031 COL1A1-EV 対 生理食塩水、*P = 0.030 COL1A1-EV MN 対 42 日目の生理食塩水; #P = 0.044 COL1A1- EV 対生理食塩水、*P = 0.016 COL1A1-EV MN 対 49 日目の生理食塩水、*P = 0.016 COL1A1-EV MN 対 56 日目の生理食塩水、#P = 0.017 COL1A1-EV 対生理食塩水、*P = 0.020 COL1A1-EV MN 63 日目の対生理食塩水; *P = 0.018 COL1A1-EV MN 対 70 日目の生理食塩水; #P = 0.011 COL1A1-EV 対 生理食塩水、**P = 0.006 COL1A1-EV MN 対 77 日目の生理食塩水; #P = 0.028 COL1A1 -EV 対 生理食塩水、*P = 0.037 COL1A1-EV MN 対 84 日目の生理食塩水、#P = 0.043 COL1A1-EV 対 生理食塩水、*P = 0.043 COL1A1-EV MN 対 91 日目の生理食塩水）および c、しわ領域90日間の研究期間中のマウスの背部皮膚（すべてのグループでn = 4; #P = 0.012 COL1A1-EV 対 生理食塩水、**P = 0.005 COL1A1-EV MN 対 7 日目の生理食塩水。 #P = 0.010 COL1A1-EV 対 生理食塩水、*P = 0.048 COL1A1-EV MN 対 14 日目の生理食塩水。 #P = 0.023 COL1A1-EV 対 生理食塩水、*P = 0.021 COL1A1-EV MN 対 21 日目の生理食塩水。 *P = 0.022 COL1A1-EV MN 対 28 日目の生理食塩水。 *P = 0.046 COL1A1-EV MN 対 35 日目の生理食塩水。 #P = 0.019 COL1A1-EV 対 生理食塩水、**P = 0.009 COL1A1-EV MN 対 42 日目の生理食塩水。 #P = 0.042 COL1A1-EV 対 生理食塩水、*P = 0.030 COL1A1-EV MN 対 49 日目の生理食塩水。 *P = 0.030 COL1A1-EV MN 対 63 日目の生理食塩水。 *P = 0.029 COL1A1-EV MN 対 70 日目の生理食塩水。 #P = 0.048 COL1A1-EV 対 生理食塩水、*P = 0.022 COL1A1-EV MN 対 77 日目の生理食塩水。 #P = 0.040 COL1A1-EV 対 生理食塩水、*P = 0.027 COL1A1-EV MN 対 84 日目の生理食塩水。 *P = 0.045 COL1A1-EV MN 対 91 日目の生理食塩水）。 すべてのデータは 3 つの独立した実験からのものであり、平均値 ± SEM として表示されます。 (b、c) の比較には二元配置 ANOVA を使用しました。

補足的な方法、結果と考察、資料、図、表、参考文献。

マウスの皮膚に HA EV を送達するマイクロニードル。

皮膚に HA EV を送達するマイクロニードルの先端の溶解の ex vivo 時間経過。

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転載と許可

You、Y.、Tian、Y.、Yang、Z. 他コラーゲン補充療法のために皮内に送達されるmRNAをカプセル化した細胞外小胞。 ナット。 バイオメッド。 工学 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41551-022-00989-w

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受信日: 2022 年 4 月 1 日

受理日: 2022 年 11 月 18 日

公開日: 2023 年 1 月 12 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41551-022-00989-w

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